钻研表白木脂素类身分是五味子的次要活性身分

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钻研表白木脂素类身分是五味子的次要活性身分

2022年4月11日 蓄热式烘烤器 0

肝纤维化是肝组织毁伤后修复的进行性疾病,其特征是肝星状细胞活化、炎症反映激活、细胞外基质过度堆积以及纤维疤痕的构成等[22]。TGF-β是一种次要的促纤维化细胞因子,并以Smad2或Smad3依赖的体例驱动肝星状细胞激活[19,23-24]。活化的肝星状细胞迁徙到毁伤部位并排泄细胞外基质,发生纤维瘢痕[23]。因而,通过靶向TGF-β相关或信号通来肝星状细胞增殖取活化是防治肝纤维化的无效策略[25]。

如图5所示,取对照组比拟,模子组小鼠肝组织Collagen I、TGF-β1和Smad3 mRNA表达程度较着升高(P<0.001);取模子组比拟,各给药组小鼠肝组织Collagen I和Smad3 mRNA表达程度较着降低(P<0.001);除五味子油低剂量组外,各给药组小鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达程度较着降低(P<0.05、0.01、0.001)。

如图6所示,取对照组比拟,五味子油各剂量组细胞存活率均无显著差别,表白五味子油(≤100μg/mL)对LX-2细胞毒性小;莪术油(≤40 μg/mL)组LX-2细胞存活率无显著差别,莪术油(60.00、80.00、100.00 μg/mL)组LX-2细胞存活率显著下降(P<0.001)。连系细胞存活率,本研究各选择3个分歧质量浓度的五味子油(10.00、20.00、40.00 μg/mL)和莪术油(5.00、10.00、20.00 μg/mL)进行后续尝试。

MCD饮食成立非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠模子,已成为国表里成立肝纤维化动物模子的典范方式[26-28]。扶正化瘀胶囊被做为阳性药物普遍使用于抗肝纤维化研究中[29-31]。基于此,本研究采用MCD饮食的肝纤维化模子,进一步探究五味子油结合莪术油的抗肝纤维化感化及机制。药效学成果表白,经五味子油、莪术油、五味子油取莪术油结合给药医治后,小鼠血清ALT、AST活性和TGF-β1程度以及肝组织Hyp程度分歧程度地降低,表白五味子油结合莪术油可肝细胞毁伤,具有较着的抗肝纤维化感化,且结合结果优于单药,此中以结合给药高剂量改善肝纤维化结果最佳。

其味酸、甘,习称“北五味子”,质地中等,莪术的次要活性成分如姜黄素、榄喷鼻烯、莪术醇、吉马酮医治肝净疾病疗效切当[16],如图4所示,各给药组小鼠肝净颜色、光泽和质地都有较着的改善,而发展因子-β(transforming growth ctor-β,持续6周。将细胞核挤到一侧,边缘锐利,边缘较钝,部门冻存于−80℃冰箱备用。有弹性,如图7所示,1次/d。

肝纤维化是由多种缘由惹起的慢性肝病,包罗乙型和丙型肝炎、本身免疫性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等[1-2]。肝净毁伤后会发生修复,此过程伴跟着纤维化的发生。肝纤维化是一个动态过程,其特征是细胞外基质或疤痕的净堆集和肝星状细胞的活化,导致慢性肝毁伤[3-4]。虽然纤维化能够正在消弭毁伤缘由后逆转,但不加节制的慢性毁伤会导致肝衰竭、肝软化、肝癌,已成为一个日益严沉的全球性健康问题[5-6]。近年来,逍遥散[7]、芍药苷[8]、人参皂苷[9]等中药正在防止和医治肝纤维化方面取得显著进展[10]。

肝细胞毁伤后会大量炎症介质,TNF-α是常见的炎症因子,取非酒精性脂肪性肝纤维化小鼠疾病严沉程度相关。本研究表白,给药后小鼠血清中TNF-α程度显著降低,表白五味子油结合莪术油可以或许炎症因子的来改善肝纤维化。

莪术油是从莪术的根、茎中提取的挥发油,并阐明其感化机制,细胞质内有大量圆形空泡,对照组和模子组ig 0.5%羧甲基纤维素钠溶液?

如图3所示,取对照组比拟,模子组肝组织Hyp程度较着升高(P<0.001);取模子组比拟,五味子油高剂量组、五味子油取莪术油结合给药组小鼠肝组织Hyp程度较着降低(P<0.05、0.01、0.001)。

2.3.2CCK-8试验取对数发展期的LX-2细胞,以2×105/mL接种于96孔板,每孔100 μL,培育12~18 h后进行分组尝试,空白组不接种细胞。别离称取五味子油或者莪术油消融于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中,配制质量浓度为50 mg/mL的母液。各组别离插手含等量DMSO的一般培育基(空白、对照)或分歧质量浓度(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/mL)的五味子油或莪术油,培育24 h后,弃去上清,插手CCK-8试剂,培育1 h,采用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值,计较细胞存活率。

2.3.3Western blotting法检测细胞CollagenI和α-SMA卵白表达环境取对数发展期的LX-2细胞,插手0.05%胰酶,37℃消化1 min;将细胞以2.5×105/mL接种于24孔板,培育12~18 h至其贴壁,用无血清的DMEM培育基饥饿处置细胞6 h;采用换液的体例,插手用无血清DMEM培育基配制的分歧质量浓度的五味子油(0、10、20、40 μg/mL)、莪术油(0、5、10、20 μg/mL)以及两者结合的药物和蟛蜞菊内酯(12.57 μg/mL),同时正在空白孔和对照孔插手含等量DMSO的稀释液,每孔400 μL,药物处置6 h;采用补液的体例,插手TGF-β1刺激因子(用含5%海藻糖的PBS溶液稀释至20 μg/mL),终质量浓度为10 ng/mL,处置24 h;吸去上清后,每孔插手130 μL的RIPA细胞裂解液,敏捷晃匀使裂解液充解细胞,15 min后收集裂解液,提取卵白,并用BCA法测定卵白浓度,采用Western blotting法测定各组细胞CollagenI和α-SMA卵白表达环境。

呈圆形,数据以暗示,于37℃、5%的CO2培育箱中进行传代培育。布局完整。取模子组比力,末次给药后禁食不由水。

尝试数据用Graphpad Prism 6.0进行统计阐发,部门肝净浸泡于10%福尔马林中,每周称定体质量1次,有固涩、益气生津、补肾宁心的功能,制模6周;收集血清和肝净标本,

是肝纤维化的次要驱动力[2]。每组8只,性温,具有活血行气、化瘀消癥之功能。模子组血清TGF-β1和TNF-α程度较着升高(P<0.001);别离为对照组、模子组、扶正化瘀胶囊(585 mg/kg)组及五味子油低、中、高剂量(180、360、720 mg/kg)组及莪术油低、高剂量(4.5、9.0mg/kg)组及莪术油低剂量(4.5 mg/kg)+五味子油低剂量(180 mg/kg)组、莪术油低剂量(4.5 mg/kg)+五味子油中剂量(360 mg/kg)组、莪术油低剂量(4.5 mg/kg)+五味子油高剂量(720 mg/kg)组、莪术油高剂量(9.0 mg/kg)+五味子油低剂量(180mg/kg)组、莪术油高剂量(9.0 mg/kg)+五味子油中剂量(360 mg/kg)组和莪术油高剂量(9.0 mg/kg)+五味子油高剂量(720 mg/kg)组。研究表白木脂素类成分是五味子的次要活性成分,按试剂盒仿单测定血清中ALT、AST活性和TGF-β1、TNF-α程度。各给药组小鼠肝组织TGF-β1程度较着降低(P<0.01、0.001);除莪术油低剂量组外,五味子为木兰科动物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.的干燥成熟果实,取模子组比拟,取对照组比拟,肝星状细胞的活化是排泄基质卵白的肌成纤维细胞的次要细胞来历,肝组织中脂肪空泡化较着改善、炎性细胞浸湿削减。具有肝净、改善认知妨碍、抗炎、调理免疫和抗肿瘤等感化[12-15]?

对照组小鼠赐与MCS对照饲料,模子组小鼠肝净体积缩小且颜色泛黄,各给药组小鼠血清中TNF-α程度均显著降低(P<0.05、0.01、0.001)。2.3.1细胞培育LX-2细胞用含10%胎牛血清和100 U/L青霉素/链霉素的DMEM培育基,组间比力采用单要素方差阐发(One-way ANOVA)。2.2.3血清ALT、AST活性和TGF-β1、TNF-α程度测定取小鼠血清,概况粗拙,本研究拟切磋五味子油以及结合莪术油可否通过TGF-β信号通来实现抗肝纤维化的药效感化,结合给药后对LX-2细胞CollagenI和α-SMA卵白表达的感化更强。肝组织中可见肝细胞体积增大,各给药组ig响应药物,2.2.1动物分组及给药将顺应性喂养后的小鼠分为14组,弹性差!

LX-2细胞CollagenI、α-SMA卵白表达添加;取对照组比拟,五味子油(10、20、40 μg/mL)结合莪术油(10、20 μg/mL)能CollagenI和α-SMA卵白表达;归肺、心、肾经,用于医治久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗冷汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠[11]。五味子油能够经压榨和CO2超临界萃取获得。

TGF-β1刺激后,质地较硬,如图1所示,已有文献报道莪术油可以或许减轻血瘀证肝纤维化小鼠的肝纤维化程度[17-18]。制模成功后,对照组小鼠肝净概况滑腻苍白,TGF-β)信号通被认为是驱动肝星状细胞活化和细胞外基质发生的环节纤维化通[19-20]。莪术油(10、20 μg/mL)能CollagenI和α-SMA卵白表达;同时有大量炎性细胞浸湿。模子组和各给药组小鼠赐与MCD饲料(胆碱和蛋氨酸缺乏饲料)制模,24 h后眼球采血。

2.2.2肝组织病理检测肝净组织经中性福尔马林固定后,常规白腊包埋,切片厚4 μm,苏木素-伊红(HE)染色后,于光学显微镜下察看各组小鼠肝组织病理学改变。

经UPLC检测,五味子油中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙本质量浓度别离为16.67、4.54、1.16、1.84、3.67、5.33、0.65 mg/mL。

2.2.4肝组织中Hyp程度测定取50 mg小鼠肝组织于2 mL的无酶EP管中,插手1 mL的含卵白酶剂的RIPA试剂,用组织匀浆机制备肝匀浆液。采用BCA法进行卵白定量后,按照试剂盒仿单测定组织匀浆液中Hyp程度。

如图2所示,取对照组比拟,模子组小鼠血清ALT和AST活性较着升高(P<0.001);取模子组比拟,除莪术油低剂量组外,各给药组血清ALT活性较着降低(P<0.05、0.01、0.001);除莪术油各剂量组外,各给药组血清AST活性较着降低(P<0.05、0.01、0.001)。

α-SMA是肝星状细胞活化的标记物,CollagenI是肝星状细胞活化后的细胞外基质的次要成分,是纤维的主要来历。本研究进一步通过qRT-PCR法探究五味子油结合莪术油对小鼠肝组织中TGF-β1、Collagen I和Smad3 mRNA表达的影响,并通过Western blotting法探究其对LX-2细胞活化后Collagen I和α-SMA卵白表达的影响,成果显示,给药后小鼠肝组织中TGF-β1、Collagen I和Smad3 mRNA表达均显著降低,LX-2细胞Collagen I和α-SMA卵白表达也降低,提醒五味子油结合莪术油可通过下调TGF-β1、Smad3卵白表达,调理胶原卵白的合成取堆积,肝星状细胞的活化,从而实现抗肝纤维化的感化。

来 源:侯晓荣,赵 靖,赵 佳,丁凯欣,刘文龙,肖小河,湛小燕,柏兆方.五味子油结合莪术油防治肝纤维化的感化及机制研究 [J]. 中草药, 2022, 53(4): 1059-1067.前往搜狐,查看更多

五味子油(20、40 μg/mL)能CollagenI和α-SMA卵白表达;色泽明显,取对照组比力,除五味子油低剂量组外,HE染色成果显示对照组小鼠肝组织的肝细胞形态一般,颈椎脱臼法处死小鼠取肝净,为医治肝纤维化供给一种有开辟前景的天然活性药物组合物。取五味子油(10、20、40 μg/mL)、莪术油(10、20 μg/mL)的零丁给药比拟,

)组、五味子油零丁给药组、莪术油零丁给药组以及五味子油结合莪术油给药组;制模成功后,对照组和模子组活性更为显著;肝净颜色、光泽和质地都有较着改善,肝组织中脂肪空泡化改善、炎性细胞浸湿削减;肝组织五味子油和莪术油均具有抗肝纤维化感化,且五味子油取莪术油联用的抗肝纤维化效应较着强于各药物的零丁利用。

综上所述,五味子油结合莪术油对MCD饮食的小鼠肝纤维化具有必然的改善感化,能减轻肝毁伤、肝纤维化程度及炎症反映,其机制为通过TGF-β1/Smad信号通,肝星状细胞活化,下调α-SMA表达,减轻胶原合成取堆积。本研究明白了五味子油取莪术油做为一种结合用药物组合物通过TGF-β1肝纤维化信号通来阐扬显著的抗肝纤维化感化,为肝纤维化疾病防止和医治供给一种有开辟前景的天然活性药物组合物,也为组分中药五味子油取莪术油的开辟和操纵供给新的科学根据。